Nach der deutsch-deutschen Vereinigung im Jahre 1990 zieht das 11. US-Panzeraufklärungsregiment im Oktober 1993 aus Fulda ab. Im September 1994 lösen die Amerikaner auch ihr Depot am Gerloser Weg auf.
Mit der deutschen Vereinigung im Jahre 1990 eröffnen sich für die Rhön als länderübergreifende Mittelgebirgsregion neue Entwicklungschancen. Am 6. März 1991 erkennt die UNESCO die Rhön grenzüberschreitend als Biosphärenreservat an. Die geschützte Landschaft umfasst mit rund 185.000 Hektar den gesamten Kernbereich der Rhön in Biosphärenreservates ist eine nachhaltige Entwicklung, die Landwirtschaft, Gewerbe, Tourismus und Naturschutz in Einklang miteinander bringt und so die Gesamtqualität des regionalen Lebensraumes sichert. Um dieses Anliegen gemeinsam voranzubringen, gründen die Landräte der fünf Rhön-Kreise und die Vorsitzenden der drei Biosphärenreservatsverwaltungen der Bundesländer im Jahr 2000 die „Regionale Arbeitsgemeinschaft Rhön“ (ARGE Rhön).
1995 wird die Lokale Nahverkehrsgesellschaft Fulda mbH (LNG Fulda) gegründet. Sie ist eine Tochtergesellschaft des Landkreises Fulda. Die LNG Fulda verantwortet die Ausgestaltung und Finanzierung des öffentlichen Personennahverkehrs in der Region. Sie ist zudem Bindeglied zum Rhein-Main-Verkehrsverbund (RMV), der den überregionalen Verkehr und übergreifende Aufgaben wie das Fahrpreissystem organisiert.
Der Hessische Landtag beschließt 1999 das „Gesetz zur Stärkung der Bürgerbeteiligung und kommunalen Selbstverwaltung”. Dieses sieht nicht nur umfangreiche Änderungen in der hessischen Gemeinde- und Landkreisordnung vor, sondern auch im Kommunalwahlgesetz. Nun ist eine Mehrstimmensetzung pro Kandidat und eine individuelle Stimmenverteilung auf unterschiedliche Parteien möglich. Die Sperrklausel fällt weg.
2001 wird im Alten Schlachthof in Fulda das Informationstechnologie-, Gründer- und Multimedia-Zentrum eröffnet. Neben neu gegründeten Firmen aus dem Informatik- und Elektrotechnikbereich, die hier eine Existenzgründungsförderung erhalten, beherbergt das „ITZ“ etablierte High-Tech-Unternehmen und Dienstleister, sowie Konferenz- und Tagungsräume. Die Stadt und der Landkreis Fulda beteiligen sich als Gesellschafter an dem Gründerzentrum. 2016 wird die ITZ GmbH in Region Fulda Wirtschaftsförderungsgesellschaft mbH umbenannt.
Mit Inkrafttreten des zweiten Sozialgesetzbuchs 2005 übernimmt der Landkreis Fulda die Verantwortung für die Betreuung und Vermittlung der Langzeitarbeitslosen. Dazu wird das kommunale Kreisjobcenter in der Robert-Kircher-Straße eröffnet. Sein primäres Ziel ist es, die Menschen der Region in Arbeit zu bringen. Es kümmert sich um Beratungsangebote, Förderleistungen und Leistungen nach SGB II.
Die Firma Biothan, eine Tochtergesellschaft der GWV (heute RhönEnergie), nimmt 2012 auf dem Finkenberg bei Kleinlüder eine Anlage in Betrieb, die aus organischem Abfall Biogas erzeugt. Im September 2012 geht die erste Ausbaustufe der Biothan-Anlage in Betrieb. Ab 2013 werden auch die Inhalte der Braunen Tonne des Landkreises Fulda zur Energiegewinnung genutzt.
Nach jahrzehntelangen Diskussionen, Planungen und Bauarbeiten wird im September 2014 der letzte Teilabschnitt der Autobahn A 66 fertiggestellt. Die Strecke verbindet Osthessen mit dem Rhein-Main-Gebiet und ist für die Infrastruktur, die Wirtschaft und den Tourismus der Region Fulda von besonderer Bedeutung. Dazu gehört der Tunnel Neuhof, der mit einer Länge von 1,61 Kilometern bis 2020 der längste Autobahntunnel Hessens war.
2014 zeichnet die International Dark-Sky Association (IDA) das UNESCO-Biosphärenreservat Rhön als Internationalen Sternenpark aus. Nicht nur bei Tageslicht beeindruckt die Rhön als Land der offenen Fernen, sondern gerade auch bei Nacht. Im Zentrum Deutschlands gelegen und mit einer relativ dünnen Besiedlung, kann man hier noch natürliche Nachtlandschaften mit einem sternreichen Himmel erleben. Neben einigen tausend Sternen und der Milchstraße zeigen sich hier auch das Zodiakallicht sowie schwach leuchtende Sterne und Planeten. Mit dem Titel verpflichtet sich die Region, Maßnahmen zur Reduzierung der Lichtverschmutzung umzusetzen. Nachtaktive Tiere und Pflanzen erhalten so eine natürliche Umgebung.
2017 unterzeichnen die Stadt Fulda, der Landkreis und die Industrie- und Handelskammer Fulda den Gesellschaftsvertrag für die neue Wirtschaftsförderungsgesellschaft, die Region Fulda Gmbh. Die drei gleichberechtigten Gesellschafter werden in dieser Zusammenkunft ihre Wirtschaftsförderungsaktivitäten bündeln. Die GmbH agiert als Schnittstelle zwischen kommunaler Verwaltung und Wirtschaft. Sie bildet eine „Vernetzungsplattform“ für Unternehmen untereinander sowie mit Verbänden und Stellen der öffentlichen Verwaltung.
Auch heute trägt der Landkreis mit dem Kreisgesundheitsamt die Verantwortung für den Impfschutz der Bevölkerung bei der Bekämpfung der Covid-19-Pandemie. Hierzu richtet der Landkreis im Auftrag des Landes Hessen Ende 2020 im Fuldaer Kongress- und Kulturzentrum Esperanto ein Impfzentrum ein. Für die medizinischen Leistungen des Impfzentrums und der mobilen Teams beauftragt der Landkreis die neu gegründete Impfzentrum Fulda GmbH. Er stellt damit die Infrastruktur bereit, um insbesondere vulnerable Gruppen schnell versorgen zu können. Es helfen Organisationen wie die Malteser und das Deutsche Rote Kreuz. Später kommen weitere kleinere Impfzentren hinzu.